農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化
發(fā)布時間：
2022-12-27
作者：
農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化
1.農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
取-70保存的EHA105于含50μg/毫升鏈霉素平板劃線,28培養(yǎng),挑取單菌落接種于5毫升 YM液體培養(yǎng)基中,220rpm 28振蕩培養(yǎng)12-16 hr,取2毫升菌液轉(zhuǎn)接于100毫升 YM液體培養(yǎng)基中,28220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5,轉(zhuǎn)入無菌離心管,5000rpm離心5分鐘,去上清液,加入10毫升預(yù)冷的0.1M的CaCl2溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置20分鐘,45000rpm離心5分鐘,去上清,加入4毫升預(yù)冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液,輕輕懸浮,農(nóng)桿菌懸浮液分裝于無菌Eppendorf管中,每管200μl凍存于-70,
2. 雙元載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105
取1μg左右的質(zhì)粒DNA加入到200毫升 EHA105感受態(tài)細(xì)胞中,混勻后,冰浴30分鐘,-70放置10分鐘 ,再在37水浴5分鐘或42水浴1分鐘,接著冰浴2分鐘,加入800毫升YM液體培養(yǎng)基28,175rpm搖培3hr后涂在含50μg/毫升 Kanamycin的YM平板上,28培養(yǎng)到形成單菌落,其中 YM 可以用LB 代替 ,第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代.