菌種的衰退、復(fù)壯和保藏
發(fā)布時(shí)間：
2022-12-27
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菌種的衰退、復(fù)壯和保藏
在微生物的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中,選育一株理想菌株是一件艱苦的工作,而要保持菌種的遺傳穩(wěn)定性更是困難.菌種退化是一種潛在的威脅,因此引起人們的研究與重視.
一、菌種退化現(xiàn)象:菌種退化(degeneration)是指群體中退化細(xì)胞在數(shù)量上占一定數(shù)值后,表現(xiàn)出菌種生產(chǎn)性能下降的現(xiàn)象.常表現(xiàn)為,在形態(tài)上的分生孢子減少或顏色改變,甚至變形,如放線菌和霉菌在斜面上經(jīng)多次傳代后產(chǎn)生了“光禿”型,從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難;在生理上常指產(chǎn)量的下降,例如,黑曲霉的糖化能力、抗生素生產(chǎn)菌的抗生素發(fā)酵單位下降等.造成菌種退化的原因主要有:
自然突變:微生物與其他生物類(lèi)群相比最大的特點(diǎn)之一就是有較高的代謝繁殖能力,在DNA大量快速?gòu)?fù)制過(guò)程中,因出現(xiàn)某些基因的差錯(cuò)從而導(dǎo)致突變發(fā)生,故繁殖代數(shù)越多,突變體的出現(xiàn)也越多.一般來(lái)說(shuō),微生物的突變常常是負(fù)突變,是指使菌種原有的優(yōu)良特性喪失或?qū)е庐a(chǎn)量下降的突變.只有經(jīng)過(guò)大量的篩選,才有可能找到正突變.
環(huán)境條件:環(huán)境條件對(duì)菌種退化的影響,如營(yíng)養(yǎng)條件,有人把泡盛曲霉的生產(chǎn)種,在3種培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10次,發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基和傳代次數(shù)對(duì)淀粉葡萄糖苷酶的產(chǎn)量下降有不同影響,說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)成分影響菌種退化的速度.環(huán)境溫度也是重要的作用因素.例如,溫度高,基因突變率也高,溫度低則突變率也低,因比菌種保藏的重要措施就是低溫.其他環(huán)境因子,如紫外線等誘變劑也可加速菌種退化.
衰退的防止:控制傳代次數(shù);創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件;利用不同類(lèi)型的細(xì)胞進(jìn)行接種;采用有效的菌種保藏方法.
退化菌種的復(fù)壯:因?yàn)樵谕嘶木N中仍有一些保持原有菌種特性的細(xì)胞,故有可能采取一些相應(yīng)措施,使這些細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖,以更新退化的菌株,稱(chēng)之為菌種的復(fù)壯.常用方法是純種分離;通過(guò)宿主體內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)行;淘汰已衰退的個(gè)體.
二、菌種的保藏
經(jīng)誘變篩選、分離純化以及純培養(yǎng)等一系列艱苦勞動(dòng)得到的優(yōu)良菌株,能使其穩(wěn)定地保存、保持原有的特性、不死亡、不污染,這就是菌種保藏的任務(wù).
(一)原理:人為地創(chuàng)造合適的環(huán)境條件,使微生物的代謝處于不活潑、生長(zhǎng)繁殖受抑制的休眠狀態(tài).這些人工環(huán)境主要從低溫、干燥、缺氧3方面設(shè)計(jì).
(二)常用方法:菌種的保藏方法多樣,采取哪種方式,要根據(jù)保藏的時(shí)間、微生物種類(lèi)、具備的條件等而定.下面著重介紹幾種常用的保藏方法.
1.液體石蠟覆蓋保藏法:為了防止傳代培養(yǎng)菌因干燥而死亡,也為限制氧的供應(yīng)以削弱代謝水平,在斜面或穿刺的培養(yǎng)基中覆蓋滅菌的液體石蠟.主要適用于霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細(xì)菌等的保存.霉菌和酵母菌可保存幾年,甚至長(zhǎng)達(dá)10年.本法的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單不需特殊裝置.其缺點(diǎn)是對(duì)很多厭氧細(xì)菌或能分解烴類(lèi)的細(xì)菌的保藏效果較差.液體石蠟要求選擇優(yōu)質(zhì)無(wú)毒,一般為化學(xué)純規(guī)格.可以在121濕熱滅菌20min.要求液體石蠟的油層高于斜面頂端1cm,垂直放在4冰箱內(nèi)保藏.
2.載體保藏法:使微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體上(土壤、砂子等)進(jìn)行干燥保存的方法.最常用的有砂土保藏法.主要用于能形成孢子或孢子囊的微生物(真菌、放線菌和部分細(xì)菌)的保存.此法簡(jiǎn)便,保藏時(shí)間較長(zhǎng),微生物轉(zhuǎn)接也較方便,故應(yīng)用范圍較廣.
3.冷凍干燥保藏法:這是最佳的微生物菌體保存法之一,保存時(shí)間長(zhǎng),可達(dá)10年以上.低溫冷凍可以用普通-20或更低的-50、-70冰箱,用液氮(-196)更好.無(wú)論是哪種冷凍,在原則上應(yīng)盡可能速凍,使其產(chǎn)生的冰晶小而減少細(xì)胞的損傷.不同微生物的最適冷凍速度不同.為防止細(xì)胞被凍死,保存液中應(yīng)加些保護(hù)劑,例如甘油、二甲亞礬等,它們可透入細(xì)胞,通過(guò)降低強(qiáng)烈的脫水作用而保護(hù)細(xì)胞;大分子物質(zhì)如脫脂牛奶、血清白蛋白等,可通過(guò)與細(xì)胞表面結(jié)合的方式防止細(xì)胞膜受凍傷.其缺點(diǎn)是手續(xù)麻煩、需要條件高.
4.斜面保藏法:將菌種接種在試管斜面培養(yǎng)基上,待菌種生長(zhǎng)完全后,置于4冰箱中保藏,每隔一定時(shí)間再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上,生長(zhǎng)后繼續(xù)保藏.對(duì)細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌均可采用.此方法簡(jiǎn)單、存活率高,故應(yīng)用較普遍.其缺點(diǎn)是菌株仍有一定的代謝強(qiáng)度,傳代多則菌種易變異,故不宜長(zhǎng)時(shí)間保藏菌種.